Teknik Aseptik Kultur Jaringan

STRERILISASI

                        Sterilisasi adalah proses untuk mematikan atau menonaktifkan spora dan sel vegetatif mikroorganisme sampai ke tingkat yang tidak memungkinkan lagi untuk berkembang biak atau menjadi sumber kontaminan selama proses perkembangan berlangsung.

            Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi setiap saat dalam masa kultur.

Kontaminasi dapat berasal dari:

1. Eksplan , baik internal maupun eksternal
2. Organisme kecil yang masuk dalam media.
3. Air yang digunakan
4. Botol kultur atau alat-alat tanaman yang kurang streril
5. Kecerobohan dalam pelaksanaan.

            Sterilisasi merupakan hal terpenting dalam kegiatan kultur jaringan ini, sterilisasi utama yang harus dilakukan adalah:

Ø  Sterilisasi lingkungan kerja

Ø  Sterilisasi alat dan media

Ø  Sterilisasi bahan tanaman (eksplan)

Ø  Sterilisasi lingkungan kerja (ruang)

            Untuk menunjang keberhasilan kegiatan kultur jaringan maka semua ruangan dibersihkan:

• Lantai setiap hari dipel
• Meja, kursi, lemari dan peralatan besar dibersihkan dengan pengelapan alkohol/formalin
• Penanaman eksplan, sterilisasi eksplan dan isolasi dilakukan di laminar air flow cabinet

Laminar air flow cabinet:

Laminar air flow cabinet adalah meja tempat kultur jaringan. Alat ini dilengkapi dengan blower, aliran udara halus untuk mencegah kontaminan yang bergerak di udara selama proses penanaman. Sebelum melalui pekerjaan meja disterilkaan dengan penyemprotan alkohol 70% atau formalin. Setiap kali bekerja tangan, alat atau benda yang masuk harus disemprotkan dengan alkohol 70%.

Sterilisasi alat dan media

Cara untuk mensterilkan alat adalah:

1. Alat-alat logam dam gelas dibilas dengan air kran dan detergen selama 10 menit.
2. Alat-alat tersebut dibilas hingga bersih dan dibungkus dengan kertas tebal, disterilkan dalam autoclave dengan temperatur 121⁰C tekanan 1,75 psi selama 1 jam(perhitungan waktu sterilisasi setelah tekanan yang dibutuhkan tercapai).
3. Bila botol/tabung akan disimpan unutk beberapa waktu maka setelah diautoclave disimpan dalam oven atau pensterilan alat gelas dapat langsung menggunakan oven pada suhu tinggi 150 – 200*C selam 24 jam.

Cara mensterilkan media dan air:

1. Tutup botol/tabung berisi media atau air rapat-rapat dengan alfo atau plastik tahan panas (untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misal 250 ml dengan isi 100 ml agar sterilisasi lebih efektif).
2. Setelah tabung diberi label, disterilkan dalam autoclave dengan temperatur 121⁰C , 175 psi selama 30 menit (perhitungan waktu setelah tekanan yang diinginkan tercapai).

Sterilisasi bahan tanaman (eksplan)

            Syarat pengambilan dan pemilihan eksplan:

ü  Mempunyai daya regeneragi yang tinggi.

ü  Lebih baik bahan tanaman tertutup seperti pucuk atau meristem

ü  Sehat dan tidak mengandung bibit penyakit.

Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminan yang berbeda, tergantung dari :

—  Jenis tanamannya

—  Bagian tanaman yang dipergunakan

—  Morfologi permukaan

—  Lingkungan tumbuh

—  Musim waktu mengambil

—  Umur tanaman

—  Kondisi tanaman

Cara pengambilan tunas(eksplan) untuk mempermudah pembersihan/sterilisasi:

—  Ambil tunas baru/muda karena lebih bersih dan tertutup

—  Penempatan eksplan dalam tempat tertutup akan menjaganya tetap bersih dan diletakkan pada tempat teduh

—  Semakin kecil eksplan semakin kecil kemungkinan kontaminasi terjadi,tetapi makin besar jaringan yang ada kemungkinan keberhasilan kultur akan makin tinggi.

—  Pengambilan pucuk dari tanaman dewasa perlu direjuvenilisasi dan sering kali dalam pengembangannya terjadi browning/pencoklatan karena tanaman dewasa sering kali mengeluarkan fenol.

            Untuk keberhasilan kegiatan kultur dan memperoleh sumber eksplan yang lebih bersih,sebaiknya eksplan diambil dari sumber eksplan sebagai berikut:

Ø  Dari bibit tanaman yang ditempatkan pada tempat tertentu(rumah kaca) kemudian diambil pucuk atau bagian juvenilnya.

Ø  Menumbuhkan pucuk dari biji pada media pasir steril (disemaikan)ditempatkan pada tempat  tertentu yang terlindungi dari udara luar

Urutan sterilisasi bahan tanaman  adalah sebagai berikut:

a.       Bagian potongan tanaman dibilas dengan larutan detergen dan air selama 10 kali (kalau bisa yang mengalir).

b.      Rendam dalam larutan   HgCl₂ 0,05% selama 10 menitdan dibilas dengan air steril

c.       Rendam dengan larutan NaOCl 15% selama 10 menit.

d.      Pembilasan dengan air steril 3-4 kali

Untuk b,c,d dilakukan di laminar air flow cabinet.

Untuk sterilisasi biji yang dikecambahkan langsung:

1. Biji yang akan ditanam dicuci dengan air dan detergent,untuk beberapa jenis biji perlu perendaman beberapa waktu
2. Kemudian ditanam pada media pasir steril dan dihindarkan dari udara luar(disungkup sampai pucuknya keluar)
3. Pucuk inilah yang dijadikan sebagai eksplan dengan sterilisasi hanya menggunakan NaOCl 15% dengan lama perendaman selama 7 menit.
4. Dibilas 3-4 kali

Bahan sterilisasi eksplan:

ü  Ethyl alkohol (C₂H₅OH)

ü  Calsium hypochlorite 0,8%

ü  Hydrogen peroksida 3%

ü  Mercuri clorida(HgCl2) 0,1%

ü  Antiformine (NaClO)

ü  Benzalkonium clorida